THIẾT KẾ MỒI NHÂN DÒNG
Giả sử một gene mã hoá một protein đặc thù ở vi khuẩn có trình tự nucleotide của một mạch như sau:5’-ATGACAACCCATC…………………..CCCGAGCACAAGTAA-3’
Để sản xuất ở quy mô lớn nhất loại protein này, người ta tiến hành nhân dòng đoạn gene trên vào một vector, tạo plasmid tái tổ hợp và biến nạp vào E.coli. Sau đó, người ta tiếp tục cho cảm ứng biểu hiện và sản xuất sinh khối. Để tách protein sản phẩm bằng sắc kí ái lực qua cột ion Ni2+, vector biểu hiện thường có một trình tự mã hoá 6 amino acid histadin ở đuôi carboxyl hoặc ở đầu amin. Giả sử vị trí phân dòng của vector biểu hiện có trình tự là:
5’CGCTGCAGATGAATATGCGCGGGGATCCGACCACCACCACCACCACCAC-3’
(Phần in đậm gạch chân là trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn PstI và BamHI, phần in nghiêng gạch chân là trình tự nucleotide của 6 bộ ba liên tiếp mã hoá amino acid histadin).
Đề xuất trình tự nucleotide của cặp mồi nhân dòng để protein đích được gắn thêm 6 amino acid histadin? Giải thích.
Câu 1 [1074410]: Kĩ thuật nhân dòng đoạn gene trên được ứng dụng dựa trên nguyên lí
A, gây đột biến gene.
B, kĩ thuật tách chiết DNA.
C, Công nghệ tế bào.
D, DNA tái tổ hợp.
DNA tái tổ hợp là quá trình mà các đoạn DNA từ các nguồn khác nhau được kết hợp lại để tạo thành một phân tử DNA mới. Trong trường hợp này, đoạn gene mã hóa protein được chèn vào vector biểu hiện để tạo ra plasmid tái tổ hợp, cho phép biểu hiện protein trong vi khuẩn. Đáp án: D
Câu 2 [1074411]: Trình tự nucleotide của cặp mồi nhân dòng để protein đích được gắn thêm 6 amino acid histadin là
A, Mồi xuôi: 5’-ATCCGATCCGAACACGGCCC-3’
Mồi ngược: 5’-AGATGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-AGATGCAGATGACAACCCATC-3’
B, Mồi xuôi: 5’-ATCGGATCCGAACACGGCCC-3’
Mồi ngược: 5’-AGCTGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-AGCTGCAGATGACAACCCATC-3’
C, Mồi xuôi: 5’-AGCTGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCGGATCCGAACACGGCCC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCGGATCCGAACACGGCCC-3’
D, Mồi xuôi: 5’-AGATGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCCGATCCGAACACGGCCC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCCGATCCGAACACGGCCC-3’
Để sản phẩm protein có 6 amino acid histadin ở đuôi carboxyl thì mã kết thúc của gene cần nhân dòng phải được phá bỏ để quá trình giải mã kéo dài bao trùm cả 6 bộ ba mã hoá histadin của vecto chuyển dòng. Đồng thời trình tự đoạn mồi cần phải chứa cả enzyme cắt giới hạn để có thể nhân dòng phụ sang vector biểu hiện. Mặt khác, để tách được dòng gene, tạo sản phẩm chính xác, trình tự đoạn mồi cần thiết phải bổ sung với mạch gốc.
Xem xét trình tự của vector, phía sau vị trí nhận biết chứa một bộ ba, tiếp đó là 6 bộ ba mã hoá histadin. Vì thế, đột biến phá vỡ mã kết thúc phải làm mất cả 3 nucleotide của mã kết thúc hoặc thêm số nucleotide là số chia hết cho 3. Thông thường người ta hạn chế tăng mã bộ ba.
Trình tự nucleotide của cặp mồi tách dòng gene có thể là:
Mồi xuôi: 5’-AGCTGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCGGATCCGAACACGGCCC-3’
Ghi chú: Nucleotide đầu 5’ có thể không nhất thiết bổ sung với mạch khuôn.
Tuy nhiên, để có đoạn mồi chuẩn, chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm khác của mồi trước khi sử dụng. Để đạt các điều kiện tối ưu của mồi, có thể thêm nucleotide bất kì ở đầu 5’ hoặc kéo dài đoạn bổ sung với mạch khuôn. Đáp án: C
Xem xét trình tự của vector, phía sau vị trí nhận biết chứa một bộ ba, tiếp đó là 6 bộ ba mã hoá histadin. Vì thế, đột biến phá vỡ mã kết thúc phải làm mất cả 3 nucleotide của mã kết thúc hoặc thêm số nucleotide là số chia hết cho 3. Thông thường người ta hạn chế tăng mã bộ ba.
Trình tự nucleotide của cặp mồi tách dòng gene có thể là:
Mồi xuôi: 5’-AGCTGCAGATGACAACCCATC-3’
Mồi ngược: 5’-ATCGGATCCGAACACGGCCC-3’
Ghi chú: Nucleotide đầu 5’ có thể không nhất thiết bổ sung với mạch khuôn.
Tuy nhiên, để có đoạn mồi chuẩn, chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm khác của mồi trước khi sử dụng. Để đạt các điều kiện tối ưu của mồi, có thể thêm nucleotide bất kì ở đầu 5’ hoặc kéo dài đoạn bổ sung với mạch khuôn. Đáp án: C
Câu 3 [1074412]: Giả sử sau khi nhân dòng và cảm ứng biểu hiện, bạn không thu được lượng protein đích mong muốn qua sắc kí ái lực Ni2+. Nguyên nhân nào sau đây có khả năng cao nhất?
A, E. coli đã phân hủy hoàn toàn protein đích trước khi bạn tinh sạch.
B, Trình tự gene đích đã không được cắt chính xác, dẫn đến biểu hiện protein không gắn đuôi histidin.
C, Vector biểu hiện không có promoter hoạt động trong E. coli.
D, Cột sắc ký Ni2+ không phù hợp cho việc tách protein có đuôi histidin.
Nếu gene đích không được gắn chính xác vào vị trí chứa trình tự histidin trong vector, protein đích sẽ không có đuôi histidin, dẫn đến việc không gắn vào cột Ni²⁺ trong quá trình tinh sạch. Đáp án: B